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Abstract

抑郁癥對全球健康構(gòu)成重大威脅，開發(fā)安全有效的治療方案至關(guān)重要。梔子作為藥食同源物質(zhì)，在臨床和日常生活中應(yīng)用廣泛。梔子油脂是食品工業(yè)加工中產(chǎn)生的廢棄副產(chǎn)品，具有顯著的回收利用潛力。雖然既往研究證實了梔子油脂的抗抑郁作用，但其具體機(jī)制尚未明確。為填補這一研究空白，本文系統(tǒng)解析了梔子油脂的化學(xué)成分及其抗抑郁作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，梔子油脂主要由脂肪酸與不皂化物組成。該油脂可通過調(diào)節(jié)微生物-腸-腦軸，有效改善慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激小鼠的抑郁樣行為。其作用機(jī)制包括：改善腸道菌群失調(diào)、調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸代謝、保護(hù)腸道屏障功能、減輕海馬體損傷，并通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路激活緩解神經(jīng)炎癥。糞便微生物移植實驗證實腸道微生物群參與了梔子油脂對抑郁樣行為的調(diào)控作用。本研究確立了梔子油脂的抗抑郁功效及其作用機(jī)制，為其作為抑郁癥治療的新型膳食干預(yù)方案提供了科學(xué)依據(jù)。

Introduction

梔子作為茜草科植物梔子的干燥成熟果實，既是具有除煩功效的天然藥用植物，也是中國傳統(tǒng)食品原料。當(dāng)前從梔子中提取的天然添加劑已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，但其提取后殘留的梔子油脂并未得到有效利用。研究證實梔子油脂具有快速改善抑郁樣行為的潛力。然而既往研究采用未造模正常小鼠，僅通過單日高劑量灌胃評估效果。梔子油脂對抑郁個體的抗抑郁作用及其具體機(jī)制仍有待闡明。

微生物-腸-腦軸在抑郁癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，是極具潛力的治療靶點。腸道微生物群通過免疫炎癥反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)和代謝產(chǎn)物，積極參與胃腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的雙向調(diào)控。例如，將抑郁癥患者糞便微生物移植至健康大鼠可誘發(fā)后者出現(xiàn)抑郁行為與生理改變；臨床與動物研究均證實糞便微生物移植可改善抑郁癥狀。這表明通過腸道微生物移植可重現(xiàn)抑郁癥的行為與生理特征。

本研究提出假設(shè)：梔子油脂可通過調(diào)控微生物-腸-腦軸改善慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激小鼠的抑郁樣癥狀。為此，首先通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析梔子油脂中的脂肪酸與不皂化物組成以推斷其有效成分；進(jìn)而采用CUMS誘導(dǎo)的小鼠模型評估梔子油脂的抗抑郁功效；最后基于微生物-腸-腦軸探討其作用機(jī)制，系統(tǒng)評估其對腸道屏障、腸道菌群、海馬組織、相關(guān)信號通路及糞便移植的影響。

Results

梔子油脂化學(xué)成分分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析梔子油脂中脂肪酸與不皂化物的組成。結(jié)果顯示梔子油脂包含11種脂肪酸（圖1A），其中亞油酸（C18:2n6c，46.67%）、油酸（C18:1n9c，19.19%）、棕櫚酸（C16:0，17.17%）、己酸（C6:0，8.31%）及α-亞麻酸（C18:3n3，2.67%）為主要組分。梔子油脂中不皂化物的提取率為3.48%（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.88%），共鑒定出43種成分（圖1B），主要包含角鯊烯（23.44%）、β-谷甾醇（15.75%）、菜油甾醇（9.72%）、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烯醇（8.05%）、環(huán)木菠蘿烯醇（6.4%）和豆甾醇（4.85%）。這些成分（角鯊烯、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇）在不皂化物中的含量分別為217.75、84.75、43.20和143.76 mg/g。

圖1 梔子油脂化學(xué)成分

梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量與攝食量的影響

通過建立抑郁樣CUMS小鼠模型（圖2A），定期監(jiān)測各組小鼠體質(zhì)量與攝食量變化。實驗初期，各組間體質(zhì)量（圖2B）與攝食量（圖2C）均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。從實驗第2周至結(jié)束，CON組與CUMS組間的體質(zhì)量及攝食量差異均顯著（P＜0.05或P＜0.01）。值得注意的是，梔子油脂干預(yù)在一定程度上逆轉(zhuǎn)了這種變化趨勢。

圖2 梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為的影響

梔子油脂改善CUMS誘導(dǎo)小鼠的抑郁樣行為

如圖2D-L和圖S1所示，在第6周時，CUMS組小鼠表現(xiàn)出顯著的快感缺失、行為絕望、焦慮狀態(tài)和探索能力改變。與CON組相比，CUMS組蔗糖偏好率、開臂時間、曠場運動總距離和中心區(qū)域停留時間顯著降低（P＜0.01），攝食潛伏期、強迫游泳和懸尾實驗不動時間顯著增加（P＜0.01）。然而，經(jīng)氟西汀或梔子油脂干預(yù)后，上述抑郁樣癥狀均得到改善（P＜0.05或P＜0.01）。這些結(jié)果證實，為期4周的梔子油脂治療可緩解CUMS誘導(dǎo)小鼠的抑郁癥狀。

梔子油脂減輕海馬體損傷并調(diào)節(jié)血清BDNF水平

通過蘇木精-伊紅染色觀察海馬組織病理特征。如圖3A所示，CON組小鼠腦切片顯示海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰。而CUMS組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，輪廓模糊，出現(xiàn)核固縮和核深染現(xiàn)象。與CUMS組相比，各治療組海馬病理損傷均有不同程度減輕，其中OGF-M和OGF-H組改善尤為明顯。此外，CUMS組血清BDNF水平低于CON組（圖3B，P＜0.01），而梔子油脂治療可顯著提升BDNF水平。

圖3 梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠海馬損傷及BDNF與促炎細(xì)胞因子水平的影響

梔子油脂抑制CUMS誘導(dǎo)小鼠血清促炎細(xì)胞因子表達(dá)

如圖3C-E所示，CUMS組血清IL-1β、IL-6和TNF-α濃度顯著高于CON組（P＜0.01）。而經(jīng)梔子油脂和氟西汀治療后，這些促炎細(xì)胞因子水平均有所降低，表明梔子油脂能夠抑制CUMS誘導(dǎo)小鼠的炎癥反應(yīng)。

梔子油脂防護(hù)CUMS所致腸道屏障損傷

腸道屏障功能受損可能導(dǎo)致革蘭氏陰性菌脂多糖進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并誘發(fā)慢性炎癥。因此，檢測了CUMS程序及梔子油脂干預(yù)對腸道屏障通透性的影響。

首先通過蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)腸組織病理變化。如圖4A所示，CON組未見黏膜組織損傷和炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；而CUMS組結(jié)腸隱窩明顯縮短或破壞，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤；梔子油脂干預(yù)組較CUMS組則顯示炎性細(xì)胞浸潤減輕。通過測量結(jié)腸隱窩深度進(jìn)一步評估梔子油脂對腸道屏障的影響，發(fā)現(xiàn)CUMS組結(jié)腸隱窩深度低于CON組，而在OGF-M和OGF-H組中該病理變化得到顯著逆轉(zhuǎn)（圖4B）。

圖4 梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠腸道屏障通透性的影響

二胺氧化酶是腸上皮細(xì)胞內(nèi)的一種高活性胞內(nèi)酶，當(dāng)腸黏膜屏障受損時會釋放入血。為進(jìn)一步評估腸道屏障完整性，通過ELISA試劑盒檢測了腸道屏障功能血清指標(biāo)（二胺氧化酶和脂多糖）。如圖4C和D所示，CUMS刺激使小鼠血清中二胺氧化酶和脂多糖水平升高（P＜0.01），而梔子油脂干預(yù)則降低了二者水平。該結(jié)果表明梔子油脂可減輕CUMS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷。

機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的最重要組成部分，其中腸上皮細(xì)胞間的緊密連接在調(diào)節(jié)腸黏膜屏障通透性中起關(guān)鍵作用。為此，通過蛋白質(zhì)印跡分析了結(jié)腸中關(guān)鍵緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表達(dá)。如圖4E-H所示，與CON組相比，CUMS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸中ZO-1、occludin和claudin-1蛋白表達(dá)均下降（P＜0.01）。重要的是，梔子油脂治療可逆轉(zhuǎn)抑郁小鼠中這三種緊密連接蛋白的下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

梔子油脂影響CUMS誘導(dǎo)小鼠腸道微生物多樣性

通過β-多樣性分析評估梔子油脂干預(yù)是否影響小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。組間加權(quán)UniFrac距離大于組內(nèi)距離（圖5A，P＜0.01），證明分組合理性。此外，基于操作分類單元的主坐標(biāo)分析和非度量多維尺度分析顯示，CUMS組與CON組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（圖5B和C）。因此，梔子油脂治療可改善CUMS誘導(dǎo)小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成，使其恢復(fù)至正常狀態(tài)。

圖5 梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠腸道微生物β-多樣性及組成的影響

梔子油脂調(diào)控CUMS誘導(dǎo)小鼠腸道微生物組成與功能

在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、脫硫桿菌門、疣微菌門和變形菌門為樣本中的優(yōu)勢菌門（圖5D）。與CON組相比，CUMS組厚壁菌門豐度顯著升高（圖5D，P＜0.01），而擬桿菌門和螺旋體門豐度降低（P＜0.01）。與CUMS組相比，OGF組厚壁菌門豐度顯著降低（P＜0.01），擬桿菌門豐度升高（P＜0.01）。此外，梔子油脂干預(yù)逆轉(zhuǎn)了CUMS誘導(dǎo)的厚壁菌門/擬桿菌門比值失衡。

在屬水平上，各組樣本的腸道微生物組成如圖5E所示。與CON組相比，CUMS組毛螺菌科NK4A136_group、乙酸桿菌屬和扭鏈瘤胃球菌屬豐度顯著上升，而Muribaculaceae和真桿菌屬豐度明顯下降。梔子油脂治療顯著逆轉(zhuǎn)了這些菌屬的豐度變化。此外，圖5E和圖S3展示了在CUMS組或OGF組中呈現(xiàn)下降或上升趨勢的其他微生物。綜上所述，梔子油脂可緩解CUMS誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)。

通過LEfSe分析獲得CON-CUMS和CUMS-OGF比較中具有顯著豐度差異的腸道微生物，其線性判別分析分布柱狀圖和分類分支圖見圖6A-D。交叉分析獲得梔子油脂治療CUMS誘導(dǎo)小鼠過程中可調(diào)控的微生物群：其中上調(diào)菌群包括c_Bacteroidia、p_Bacteroidota、o_Bacteroidales、f_Muribaculaceae、g_Muribaculaceae、g_Clostridia_vadinBB60_group、f_Clostridia_vadinBB60_group、o_Clostridia_vadinBB60_group和s_Alistipes_timonensis；下調(diào)菌群包括p_Firmicutes、f_Lachnospiraceae、o_Lachnospirales、c_Clostridia、g_Lachnospiraceae_NK4A136_group、g_Lachnospiraceae_UCG_008、g_Ruminococcus_torques_group和o_Enterobacterales。此外，通過PICRUSt2分析獲得三組間具有顯著差異的KEGG通路（圖6E）。

圖6 梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠腸道菌群差異物種、代謝功能及盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸水平的影響

梔子油脂恢復(fù)CUMS誘導(dǎo)小鼠盲腸短鏈脂肪酸水平

由于短鏈脂肪酸水平與觀察到的腸道菌群變化密切相關(guān)，檢測了小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸濃度（圖6F）。乙酸、丙酸和丁酸是盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸的主要組分。CUMS組乙酸、丙酸、丁酸及短鏈脂肪酸總量均高于CON組（P＜0.05或P＜0.01），而梔子油脂干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象（P＜0.01）。因此，梔子油脂通過調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸濃度發(fā)揮抗抑郁作用。

抑郁行為指標(biāo)-炎癥因子-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子-腸道屏障指標(biāo)-腸道菌群-短鏈脂肪酸的相關(guān)性分析

如圖7A所示，抑郁相關(guān)行為指標(biāo)（蔗糖偏好實驗、新奇環(huán)境抑制攝食實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、曠場實驗和高架十字迷宮實驗）與促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及腸道屏障功能生化指標(biāo)（二胺氧化酶和脂多糖）均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。在屬水平篩選的6種腸道微生物中，促炎細(xì)胞因子和腸道屏障相關(guān)指標(biāo)與Muribaculaceae豐度呈負(fù)相關(guān)，與毛螺菌科NK4A136_group豐度及短鏈脂肪酸濃度呈正相關(guān)；而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與上述微生物豐度和短鏈脂肪酸濃度呈現(xiàn)相反的相關(guān)性模式。綜上所示，可以推測梔子油脂通過改變腸道菌群組成、調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸、修復(fù)腸道屏障功能及減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗抑郁活性。

圖7 梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠相關(guān)性分析及TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影響

梔子油脂逆轉(zhuǎn)CUMS誘導(dǎo)的小鼠海馬TLR4/NF-κB/NLRP3通路激活

鑒于促炎細(xì)胞因子與抑郁行為指標(biāo)及腸道菌群的顯著關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步檢測了梔子油脂對CUMS誘導(dǎo)小鼠海馬TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影響。如圖7B所示，CUMS導(dǎo)致TLR4、p-NF-κB、NLRP3、ASC和IL-1β蛋白水平升高，并顯著激活Caspase-1（P45）向cleaved Caspase-1（P20）的轉(zhuǎn)化（P＜0.01）。值得注意的是，梔子油脂能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。此外，海馬組織中IL-1β蛋白表達(dá)的變化與血清檢測結(jié)果一致。

CUMS或OGF菌群移植對受體小鼠體質(zhì)量及抑郁樣行為的影響

通過糞便微生物移植實驗驗證梔子油脂確實通過腸道菌群改善小鼠抑郁（圖8A）。與移植CON菌群（FMT-CON）的受體小鼠相比，移植CUMS菌群（FMT-CUMS）的小鼠體質(zhì)量下降（圖8B）；而移植OGF菌群（FMT-OGF）的小鼠體質(zhì)量則高于FMT-CUMS組。三組受體小鼠的攝食量無顯著差異（圖8C）。與FMT-CON組相比，F(xiàn)MT-CUMS組小鼠在蔗糖偏好實驗、新奇環(huán)境抑制攝食實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、曠場實驗和高架十字迷宮實驗中表現(xiàn)出更多抑郁癥狀（圖8D-J）。值得注意的是，與FMT-CUMS組相比，F(xiàn)MT-OGF組的抑郁樣行為得到顯著改善。

圖8 CUMS或OGF菌群移植對受體小鼠體質(zhì)量及抑郁樣行為的影響

Conclusion

本研究證實梔子油脂可通過調(diào)控微生物-腸-腦軸緩解CUMS誘導(dǎo)的抑郁樣行為。角鯊烯、β-谷甾醇、α-亞麻酸與藏花素可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的主要活性成分，這為梔子油脂作為膳食植物油的開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。其作用機(jī)制涉及多條通路：調(diào)節(jié)腸道菌群組成、抑制短鏈脂肪酸過量生成、修復(fù)腸道屏障通透性、減輕海馬組織損傷、抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路激活以及降低炎癥反應(yīng)。本研究為梔子油脂作為抑郁癥替代療法提供了科學(xué)依據(jù)，同時促進(jìn)了其作為膳食油脂的資源化利用。

Gardeniae Fructus oil alleviate depression-like behaviors via the microbiota-gut-brain axis in mice with chronic unpredictable mild stress

Man Han1, Fei Zeng1, Yi Liu, Wenxin Shi, Shijuan Shao, Chunchao Yan*, Yunzhong Chen*

Hubei Provincial Research Center for TCM Health Food Engineering, Hubei Shizhen Laboratory, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Depression poses a considerable threat to global health, underscoring the critical need for safe treatments. Because of its homology of medicine and food, Gardeniae Fructus is widely used in clinical and every-day life contexts. Gardeniae Fructus oil (OGF) is a waste byproduct of the food industry with promising recycling potential. While previous research has demonstrated the antidepressant effects of OGF, the precise mechanism remains unclear. To fill this gap in the literature, this paper elucidates the composition and potential antidepressant mechanism of OGF. According to the results, OGF is mainly composed of fatty acids and unsaponifiable matter. OGF could effectively attenuate depression-like behaviors in mice with chronic unpredictable mild stress by modulating the microbiota-gut-brain axis. Mechanisms include improving gut dysbiosis, regulating short-chain fatty acids, protecting the intestinal barrier function, reducing hippocampal damage, and alleviating neuroinflammation by inhibiting the activation of the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway. Fecal microbiota transplantation experiments confirmed the involvement of the gut microbiota in the modulation of depression-like behavior by OGF. This study establishes the antidepressant effects of OGF as well as the underlying mechanism, demonstrating its potential as a novel dietary intervention for depression treatment.

Reference:

HAN M, ZENG F, LIU Y, et al. Gardeniae Fructus oil alleviate depression-like behaviors via the microbiota-gut-brain axis in mice with chronic unpredictable mild stress[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250403. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250403.

翻譯： 林安琪 （實習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網(wǎng)