生殖健康依賴于胎兒生殖細胞(fetal germ cell, FGC)的正常發(fā)育, 在人類中, 這一過程受到復雜而精密的調(diào)控. 其中, X連鎖基因的劑量在人類FGC的發(fā)育過程中受到精確調(diào)節(jié) [ 1 , 2 ] . 研究表明人類FGC在早期發(fā)育過程中存在X染色體重新激活(X-chromosome reactivation, XCR)的現(xiàn)象, 導致雌性FGCs中X連鎖基因的劑量約為雄性FGC的1.6倍 [2] . 與此同時雄性FGC中X連鎖基因與常染色體基因的表達比率低于1, 且該比率低于周圍體細胞中的水平 [3] , 這證明雄性FGC的發(fā)育需要相對較低劑量的X連鎖基因. 然而, 對于異常劑量的X連鎖基因如何損害人類FGC的發(fā)育, 目前仍知之甚少.

克氏綜合征(Klinefelter syndrome, KS)是男性最常見的性染色體異常疾病之一, 影響約1/600的男性群體 [4] . 這類患者比正常男性(46, XY)多出一條X染色體, 其染色體為(47, XXY), 其典型臨床表現(xiàn)為青春期后生殖細胞大量丟失、睪丸組織纖維化以及無精子癥, 導致生育能力嚴重受損 [5] . 既往研究多聚焦于患者青春期后階段, 此時生殖細胞已基本丟失, 目前僅記錄到性腺體細胞有限分子異常 [ 6 , 7 ] , 而KS患者不育的根本原因和起始事件, 尤其是生殖細胞早期發(fā)育缺陷及相關分子調(diào)控異常的機制尚不明確.

針對以上問題, 2024年, 北京大學第三醫(yī)院喬杰團隊在 Nature 發(fā)表題為“How the extra X chromosome impairs the development of male fetal germ cells”的研究論文. 該團隊基于前期發(fā)現(xiàn)的人類FGC在早期發(fā)育過程中存在XCR這一關鍵特征, 以KS患者FGC額外攜帶一條X染色體的特點作為天然研究模型, 以胎兒期生殖細胞研究為揭示發(fā)育異常的關鍵切入點, 揭示了X染色體劑量異常導致男性胎兒生殖細胞發(fā)育障礙的關鍵機制 [8] .

研究首先明確了KS患者的FGC在胎兒階段就出現(xiàn)了發(fā)育異常. 研究選用KS胎兒、男性和女性對照胎兒的性腺為研究對象, 進行后續(xù)多項研究. 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn), KS患者性腺中FGC處于早期階段的比例顯著高于男性對照. 與此同時, 兩組的FGC總數(shù)無顯著差異, 提示KS患者的FGC存在發(fā)育阻滯而非細胞丟失. 這一發(fā)現(xiàn)有力顛覆了將生殖細胞丟失主要歸因于青春期事件的傳統(tǒng)觀點, 證明發(fā)育障礙早在出生前就已發(fā)生.

進而, 該研究深入解析了KS患者的FGC的基因表達譜, 發(fā)現(xiàn)其存在顯著的基因調(diào)控失常. 在早期FGC中, 組蛋白修飾、WNT(wingless-related integration site)/TGF-β(transforming growth factor-β)、去甲基化等通路基因上調(diào), 而分化相關基因, 如piRNA代謝、減數(shù)分裂相關基因則表達下調(diào), 且NODAL信號增強、多能性提高等, 表明早期FGC多能性增強而分化潛能降低. 而在晚期FGC中, DNA復制、染色體分離相關基因上調(diào), 表明細胞未完全進入有絲分裂停滯期, 同時遷移及早期FGC標志物上調(diào), 向精原細胞過渡的關鍵基因下調(diào), 整體顯示晚期FGC仍處于幼稚狀態(tài).

與此同時, 研究團隊發(fā)現(xiàn)額外X染色體對KS患者的FGC的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和發(fā)育缺陷具有關鍵影響. 首先, 研究團隊通過等位基因表達分析和免疫熒光染色證實了KS患者的FGC中兩條X染色體均處于活躍狀態(tài). 隨后通過RNA/DNA/蛋白三重熒光原位檢測技術(triple in situ fluorescence, TISF)結(jié)合空間統(tǒng)計學算法深入探究了X染色體失活(X chromosome Inactivation, XCI)失敗的具體機制. 研究發(fā)現(xiàn), 啟動XCI的長鏈非編碼RNA——X失活特異性轉(zhuǎn)錄本(X-inactive specific transcript, XIST)在KS患者的FGC中雖有表達, 并隨FGC分化逐漸下調(diào)直至消失, 但并未能介導XCI. 與此同時, 人類特異性長鏈非編碼RNA——X染色體活性涂層轉(zhuǎn)錄本(X-active coating transcript, XACT)在KS患者的FGC中表達更為廣泛, 同樣隨細胞分化而下調(diào)并消失. 既往研究表明, XACT可干擾XIST的表達與定位, 進而影響其功能 [ 9 , 10 ] . 本研究的空間共定位分析進一步發(fā)現(xiàn), 在KS患者的FGC中, 部分XACT定位于XIST所形成的“云”狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部, 提示XACT可能通過物理阻礙XIST附著于X染色體, 從而拮抗其沉默功能, 導致XCI無法發(fā)生. 結(jié)合其他人類FGC的研究數(shù)據(jù), 推測FGC中XCI缺失的潛在機制可能還包括: XIST無法有效覆蓋X染色體、XACT的拮抗作用以及其他尚未闡明的機制. 此外由于存在兩條活躍的X染色體, KS患者的FGC中X連鎖基因的表達劑量遠高于男性對照, 早期為男性對照的1.68倍, 晚期為1.59倍. 值得注意的是, 上調(diào)的X連鎖基因顯著富集于大多數(shù)與FGC發(fā)育缺陷相關的關鍵通路中, 直接干擾WNT通路、組蛋白修飾、細胞周期等關鍵生物學過程, 并抑制X連鎖的癌/睪丸抗原(X-linked cancer-testis antigen genes, CTX)基因介導的精原干細胞分化程序, 最終損害KS患者的FGC發(fā)育.

此外, 研究發(fā)現(xiàn)KS患者的FGC表觀遺傳異常也可能是其發(fā)育阻滯的原因. 通過單細胞三組學測序(scTrio-seq)表征性腺細胞的DNA甲基化圖譜, 發(fā)現(xiàn)KS患者的FGC經(jīng)歷異常的DNA甲基化重編程. KS早期FGC整體甲基化水平低于對照組, 且關鍵印記控制區(qū)經(jīng)歷更徹底的擦除. 盡管基因表達與啟動子甲基化整體關聯(lián)有限, 但KS晚期FGC中 CTX 基因啟動子甲基化水平顯著升高, 可能導致其表達降低, 從而阻礙分化. 此外, KS患者的FGC中特定重復元件(SINE-VNTR-Alu, SVA)呈現(xiàn)高甲基化, 其異常表觀狀態(tài)可能參與發(fā)育阻滯 [ 11 , 12 ] .

生殖細胞發(fā)育不僅依賴內(nèi)在基因程序, 也受周圍體細胞微環(huán)境的精細調(diào)控. 除發(fā)育阻滯外, 遷移受損是導致KS患者生殖細胞減少的另一關鍵因素. 在正常男性胎兒中, 支持細胞與晚期FGC于妊娠后期向睪丸索基底部遷移, 期間晚期FGC進一步分化為精原干細胞. 反之, 若無法完成遷移, 晚期FGC則會因分化異常死亡 [ 13 ~ 15 ] . 由此, 研究團隊通過單細胞轉(zhuǎn)錄組學(single-cell transcriptomics)技術, 描繪了KS患者的性腺體細胞的轉(zhuǎn)錄特征及其與FGC的相互作用. 結(jié)果表明, KS患者的分化支持細胞亞群(SC1和SC2)中, 與發(fā)育、遷移、黏附及細胞骨架相關基因表達顯著下調(diào), 表明KS的支持細胞譜系存在缺陷, 其遷移和運動功能受到損害. 并且使用CellChat分析性腺細胞間的相互作用時發(fā)現(xiàn), 除了WNT和TGF-β通路的過度激活外, 遷移相關的互作信號也顯著減少, 免疫熒光驗證了這種相互作用缺陷. 此外, 空間組學(stereo-seq)和免疫熒光顯示, 男性對照中的晚期FGC傾向于分布在生精小管的基底區(qū)域, 而KS患者中的晚期FGC則更傾向于分布在小管中心, 且KS患者的支持細胞核層厚度更大、晚期FGC基底分布比例更低, 證實支持細胞與FGC向基底膜的遷移受損.

最后, 該研究采用體外性腺培養(yǎng)系統(tǒng)探究KS患者FGC的分化能力及潛在的治療干預手段. 研究發(fā)現(xiàn)正常男性胎兒性腺組織在體外可以有效分化, 而KS胎兒性腺組織未出現(xiàn)分化. 但是, 當使用TGF-β抑制劑SB431542處理4例KS性腺組織后, 3例組織的分化能力顯著提升, 另1例也呈現(xiàn)上升趨勢, 證實了KS生殖細胞分化能力低下, 但靶向抑制TGF-β通路可有效改善其分化阻滯.

綜上所述, 該研究深入探究KS患者的生殖細胞發(fā)育異常, 首次系統(tǒng)揭示了額外X染色體通過多維度機制破壞男性生殖細胞發(fā)育的完整圖景, 探明了KS患者生殖細胞丟失的核心機制: KS患者的FGC中額外X染色體逃避失活, 導致X連鎖基因異常高表達, 進而引發(fā)一系列下游通路紊亂, 導致FGC發(fā)育阻滯; 同時, 表觀遺傳層面的異常可能進一步加劇了阻滯. 此外, 支持細胞遷移能力的下降及細胞通訊減弱, 致使FGC無法向睪丸索基底部遷移, 造成遷移受損, 形成了“發(fā)育阻滯-遷移受阻”的惡性循環(huán), 最終都會導致其出生后生殖細胞數(shù)量減少. 不僅如此, 該研究還創(chuàng)新性地提出靶向干預策略, 發(fā)現(xiàn)TGF-β抑制劑可以恢復KS性腺組織的分化能力, 改善發(fā)育障礙( 圖1 ).

圖1 額外X染色體多維度影響男性胎兒生殖細胞發(fā)育機制圖

值得注意的是, 盡管該研究取得了上述成果, 但仍存在若干有待完善之處, 這也為后續(xù)相關領域的深入探索指明了重要方向. 首先, 當前采用的體外培養(yǎng)系統(tǒng)是一個高度簡化且受控的環(huán)境, 雖能精確控制變量, 但與體內(nèi)真實的睪丸微環(huán)境仍存在差異. 因此未來研究需建立更接近生理條件的模型或者開展臨床試驗, 以驗證TGF-β抑制劑在復雜微環(huán)境中的促分化效力. 其次, 研究提示TGF-β抑制劑對嵌合型KS患者可能同樣適用甚至更具潛力, 但這一假設仍需通過直接實驗驗證. 未來通過納入嵌合型患者樣本, 有望揭示其生殖細胞異質(zhì)性對藥物響應的具體機制, 為該類患者的精準治療提供依據(jù). 最后, TGF-β在多種生理過程中至關重要, 系統(tǒng)性抑制該通路可能會對生殖系統(tǒng)以外的器官或功能產(chǎn)生不良影響. 因此, 系統(tǒng)評估該抑制劑的潛在副作用及組織特異性安全性, 將是走向應用前不可或缺的一環(huán).

然而該研究依舊填補了生殖發(fā)育生物學的重要空白, 開創(chuàng)了遺傳性不育癥的胎兒期機制解析與干預先河. 相信隨著未來研究的深入, 針對克氏綜合征等遺傳性不育癥的早期干預策略將逐步成熟, 最終實現(xiàn)從“機制解析”到“生育力挽救”的跨越.

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