研究概述

糖尿病創(chuàng)面因高血糖導(dǎo)致的慢性炎癥、血管新生障礙和細(xì)菌感染（感染率50-60%）而難以愈合，常發(fā)展為慢性潰瘍甚至截肢。傳統(tǒng)敷料僅被動(dòng)覆蓋創(chuàng)面，無(wú)法同時(shí)解決感染監(jiān)測(cè)、免疫調(diào)節(jié)和血管再生三大關(guān)鍵問(wèn)題。

盡管已有研究利用水凝膠、干細(xì)胞外囊泡（sEVs）或天然活性成分（如花青素）分別針對(duì)感染控制、巨噬細(xì)胞極化（M2型）或促血管生成，但缺乏整合診斷與治療功能的系統(tǒng)性設(shè)計(jì)，且糖尿病創(chuàng)面愈合速度仍顯著低于非糖尿病創(chuàng)面。

基于此，本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種名為“Tri-Act”的雙層智能水凝膠敷料（AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR），上層利用富含花青素的桑葚提取物實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面感染的可視化pH監(jiān)測(cè)，下層裝載miR-210-3p工程化小細(xì)胞外囊泡（sEVsmiR），通過(guò)pH響應(yīng)釋放協(xié)同發(fā)揮抗菌、抗氧化、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化和血管新生等多重作用，顯著加速糖尿病感染創(chuàng)面愈合，效果優(yōu)于傳統(tǒng)治療，為糖尿病創(chuàng)面管理提供了新的診療一體化策略。

AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR制備過(guò)程及其促進(jìn)傷口愈合的作用示意圖

相關(guān)研究成果以“Mulberry-inspired tri-act hydrogel for visual monitoring and enhanced diabetic wound repair”為題，發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》（中科院醫(yī)學(xué)1區(qū)/IF 13.2）。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院劉國(guó)輝、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院薛航、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院劉夢(mèng)非、重慶大學(xué)生物工程學(xué)院馮茜為其共同通訊作者。

圖文結(jié)果

本研究構(gòu)建了一種“Tri-Act”雙層水凝膠敷料（AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR），上層為含桑葚花青素提取物（MFE）的海藻酸/醛化透明質(zhì)酸（AlgHA-MFE）層，利用其pH響應(yīng)變色實(shí)現(xiàn)感染可視化；下層為負(fù)載miR-210-3p工程化小細(xì)胞外囊泡（sEVsmiR）的Schiff堿交聯(lián)透明質(zhì)酸（sHA）層，可緩釋sEVsmiR。實(shí)驗(yàn)先制備并表征sEVsmiR，驗(yàn)證其促進(jìn)HUVEC增殖、遷移和血管生成的能力；隨后合成并優(yōu)化雙層水凝膠的理化性能，確認(rèn)其可注射、自愈合、抗菌、止血和生物相容性。在糖尿病大鼠感染創(chuàng)面模型中，該敷料通過(guò)抗氧化、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化和增強(qiáng)血管新生，顯著加速愈合，且效果優(yōu)于非糖尿病對(duì)照，實(shí)現(xiàn)了感染實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與治療一體化。

圖 1、miR-210-3p工程化小細(xì)胞外囊泡（sEVs）的表征及其增強(qiáng)的血管生成效應(yīng)。(A) sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 的透射電鏡（TEM）圖像。(B) sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 的納米顆粒跟蹤分析（NTA）結(jié)果。(C) 不同 sEVs 中 CD9、CD81、TSG101 和 calnexin 的 Western blot 鑒定。(D) sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 中 miR-210-3p 的相對(duì)表達(dá)量。(E) HUVECs 攝取 sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 的代表性圖像。(F) HUVECs 經(jīng) sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 處理后 miR-210-3p 的相對(duì)表達(dá)量。(G) HUVECs 經(jīng) sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 處理后的相對(duì)細(xì)胞活力。(H) HUVECs 經(jīng)三種不同小細(xì)胞外囊泡處理后的細(xì)胞周期結(jié)果。(I) HUVECs 在不同細(xì)胞周期階段的占比定量分析。(J) HUVECs 接受不同處理后的劃痕實(shí)驗(yàn)代表性圖像及 (K) 遷移率。(L) HUVECs 經(jīng) PBS、sEVs、sEVsmiR-inhibitor 和 sEVsmiR 處理后的管腔形成實(shí)驗(yàn)代表性圖像。管腔形成實(shí)驗(yàn)中 (M) 分支點(diǎn)數(shù)量和 (N) 總分支長(zhǎng)度的定量分析。

圖 2、sHA水凝膠的制備與表征。(A) sHA合成的宏觀觀察。(B) sHA水凝膠的可注射性能。(C) sHA水凝膠的自修復(fù)性能。(D) 不同固含量（2%、4%、6%）sHA水凝膠的SEM圖像。(E) 不同固含量（2%、4%、6%）sHA水凝膠的時(shí)間掃描測(cè)試和(F) 應(yīng)變掃描測(cè)試。(G) 4% sHA水凝膠的連續(xù)階躍應(yīng)變測(cè)試。

圖 3、AlgHA/sHA雙層水凝膠的合成與表征。(A) AlgHA/sHA合成過(guò)程的宏觀觀察。(B) AlgHA與sHA水凝膠連接情況的觀察。(C) AlgHA、sHA及AlgHA/sHA水凝膠的溶脹比。(D) AlgHA、sHA及AlgHA/sHA水凝膠在pH 7.4和pH 5.0下的降解特性。(E) AlgHA/sHA在pH 5.0的PBS溶液中浸泡6天前后的照片。(F) 花青素和(G) sEVs在pH 5.0和pH 7.4的PBS溶液中從水凝膠中的釋放百分比。

圖 4、水凝膠的抗菌性、止血能力及生物相容性。(A) PBS、氨芐西林、AlgHA、sHA、AlgHA/sHA、AlgHA-MFE/sHA、AlgHA-MFE/sHA-sEVs、AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落。(B) 金黃色葡萄球菌和(C) 大腸桿菌的CFU計(jì)數(shù)。(D) 止血實(shí)驗(yàn)示意圖。(E) PBS、明膠海綿、AlgHA、sHA及AlgHA/sHA水凝膠處理后的肝臟出血照片。(F) 肝臟失血量的定量分析。(G) 紅細(xì)胞與PBS、不同水凝膠及Triton X-100共孵育后的溶血情況。(H) 溶血率的定量分析。

圖 5、基于pH檢測(cè)的傷口感染可視化監(jiān)測(cè)。(A) MFE溶液在pH 4–10范圍內(nèi)的照片。(B) AlgHA-MFE水凝膠在不同pH溶液中浸泡后的照片。(C) AlgHA-MFE水凝膠與細(xì)菌培養(yǎng)基共孵育不同時(shí)間點(diǎn)（0、6、12、24和48小時(shí)）的照片。(D) 使用pH試紙測(cè)定糖尿病大鼠在金黃色葡萄球菌感染前后傷口的pH值。(E) AlgHA-MFE和AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR水凝膠應(yīng)用于感染或未感染糖尿病傷口的照片。

圖 6、AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR 促進(jìn)血管生成的效果與機(jī)制。(A) 采用 DCFH-DA 檢測(cè) HUVEC 內(nèi) ROS 水平。(B) 不同處理后第 1、2、3 天 HUVEC 的相對(duì)細(xì)胞活力。(C) 不同處理 2 天后 HUVEC 的細(xì)胞周期結(jié)果。(D) 各細(xì)胞周期階段細(xì)胞比例。(E) 劃痕實(shí)驗(yàn) 0 和 24 h 的 HUVEC 顯微圖像。(F) HUVEC 24 h 遷移率的定量分析。(G) 管腔形成實(shí)驗(yàn)顯微圖像。(H) 管腔形成實(shí)驗(yàn)總分支長(zhǎng)度和 (I) 分支點(diǎn)的定量分析。(J) HUVEC 中抗氧化酶及 PERK 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。(K) 用于檢測(cè) EFNA3 及 PI3K/AKT/VEGFA 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的 Western blot 結(jié)果。(L) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及抗氧化酶相對(duì)表達(dá)的定量分析。(M) EFNA3 及 PI3K/AKT/VEGFA 通路蛋白的相對(duì)表達(dá)。G1、G2、G3、G4、G5、G6 分別代表對(duì)照、HG、HG+AlgHA/sHA、HG+AlgHA-MFE/sHA、HG+AlgHA-MFE/sHA-sEVs、HG+AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR。

圖 7、AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR 對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。(A) Raw264.7 細(xì)胞內(nèi)吞 sEVs 和 sEVsmiR 的代表性圖像。(B) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Raw264.7 細(xì)胞中 CD86 和 (C) CD206 的表達(dá)。(D) CD86 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞和 (E) CD206 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在不同處理后的比例。Raw264.7 細(xì)胞中 (F) IL-1β、(G) TNF-α、(H) IL-10、(I) TGF-β、(J) VEGFA 和 (K) bFGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。G1、G2、G3、G4、G5、G6 和 G7 分別代表對(duì)照、IL-4、LPS、LPS+AlgHA/sHA、LPS+AlgHA-MFE/sHA、LPS+AlgHA-MFE/sHA-sEVs 和 LPS+AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR。

圖 8、AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR 水凝膠治療糖尿病感染創(chuàng)面的療效與生物安全性。(A) 評(píng)估不同水凝膠治療糖尿病感染創(chuàng)面療效的時(shí)間軸。(B) 不同處理后創(chuàng)面的宏觀圖像。(C) 多種治療方式下創(chuàng)面愈合的模擬分析。(D) 第3、7、14天的創(chuàng)面相對(duì)面積。(E) 治療3天后糖尿病感染創(chuàng)面的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。(F) 創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)的CFU計(jì)數(shù)。(G) 不同處理組心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的組織學(xué)檢查。G1、G2、G3、G4、G5和G6分別代表對(duì)照組、DM組、DM+AlgHA/sHA組、DM+AlgHA-MFE/sHA組、DM+AlgHA-MFE/sHA-sEVs組和DM+AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR組。

圖 9、水凝膠處理后傷口組織的組織學(xué)評(píng)估。(A) 第14天傷口組織的H&E染色。(B) 第14天傷口組織的Masson三色染色。(C) 使用DHE熒光染色評(píng)估傷口部位的ROS水平。(D) 傷口區(qū)域GRP78的免疫組化結(jié)果。(E) H&E染色中傷口長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析。(F) 膠原體積分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)分析。(G) 傷口ROS平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析。(H) 傷口區(qū)域GRP78免疫組化中GRP78陽(yáng)性面積的百分比。G1、G2、G3、G4、G5和G6分別代表對(duì)照、DM、DM+AlgHA/sHA、DM+AlgHA-MFE/sHA、DM+AlgHA-MFE/sHA-sEVs和DM+AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR。

圖 10、水凝膠對(duì)糖尿病感染創(chuàng)面血管生成及巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用。(A) 第3天和第7天創(chuàng)面組織中iNOS和CD206的免疫熒光染色結(jié)果。創(chuàng)面組織中iNOS平均熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析：(B) 第3天，(C) 第7天。創(chuàng)面組織中CD206平均熒光強(qiáng)度：(D) 第3天，(E) 第7天。(F) 第7天和第14天創(chuàng)面區(qū)域CD31和α-SMA的免疫熒光染色結(jié)果。創(chuàng)面區(qū)域新生血管定量：(G) 第7天，(H) 第14天。創(chuàng)面成熟血管定量：(I) 第7天，(J) 第14天。G1、G2、G3、G4、G5和G6分別代表對(duì)照組、DM組、DM+AlgHA/sHA組、DM+AlgHA-MFE/sHA組、DM+AlgHA-MFE/sHA-sEVs組和DM+AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR組。

結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種集“可視化感染監(jiān)測(cè)-免疫調(diào)節(jié)-促血管新生”于一體的“Tri-Act”雙層水凝膠敷料（AlgHA-MFE/sHA-sEVsmiR）：上層富含桑椹花青素，可隨傷口pH變化實(shí)時(shí)顯色監(jiān)測(cè)感染；下層pH響應(yīng)性釋放miR-210-3p工程化小細(xì)胞外囊泡，協(xié)同抗氧化、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化與血管新生。糖尿病感染傷口模型證實(shí)，該水凝膠抗菌率＞95%，14天內(nèi)創(chuàng)面相對(duì)面積縮小至2.1%，愈合速度優(yōu)于非糖尿病對(duì)照，為糖尿病創(chuàng)面一體化診療提供了新策略。

參考文獻(xiàn)

標(biāo)題：Mulberry-inspired tri-act hydrogel for visual monitoring and enhanced diabetic wound repair

作者：Zhenhe Zhang、Bobin Mi、Yuheng Liao、Pengzhen Bu、Xudong Xie、Chenyan Yu、Weixian Hu、Yun Sun、Qian Feng、Mengfei Liu、Hang Xue、Guohui Liu

期刊：Chemical Engineering Journal 505 (2025) 159313

DOI:10.1016/j.cej.2025.159313

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https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.159313